Interferência por RNA (RNAi) para o controle de pragas e doenças

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Autor: Andrade, E.C. Embrapa Mandioca e Fruticultura.

A pesquisa agrícola sempre busca possibilitar a produção de alimento suficiente para suprir a demanda de uma população mundial crescente. Todo este potencial alcançado deve-se a capacidade de se compreender a fundo a composição/organização dos elementos e organismos, bem como suas interações, e transformar esta informação em ferramentas inovadoras de incremento de produção.

Na área de fitossanidade, as soluções encontradas estão majoritariamente associadas a resistência genética e o controle químico. Sem dúvida, o melhoramento genético é a melhor alternativa para gerar soluções dos problemas atuais e futuros.

Na ausência de resistência genética a pragas, o emprego do controle químico se torna necessário, sendo amplamente utilizado na agricultura moderna. Entretanto, questões associadas ao custo de geração versus vida útil, passivo ambiental, tem sinalizado a necessidade de novas tecnologias de controle de pragas mais eficiente e com menor impacto ambiental.

O avanço tecnológico necessário para fazer frente aos desafios da agricultura brasileira, não requer apenas a geração e caracterização das informações genômicas das a construção de soluções tecnológicas necessárias ao setor produtivo. A tecnologia de interferência por RNA (do inglês, RNA interference, RNAi) representa esta realidade, pois está transformando um conjunto de conhecimentos em tecnologias de alto impacto e ampla aplicabilidade.

O uso de estratégias de RNAi vem sendo empregada de forma ampla e exitosa em pesquisas aplicadas em diferentes áreas da ciência. Na agricultura, a tecnologia de RNAi está sendo aplicado no controle pragas e na manipulação da expressão gênica em plantas.

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O mecanismo de RNAi

Importante entender que o RNAi é um mecanismo que ocorre naturalmente dentro das células de organismos eucariotos, e tem como principais funções o controle da expressão de genes e a defesa contra infecção por vírus.

Qualquer organismo para sobreviver e responder aos estímulos internos e externos requer que suas células sejam capazes de realizar o controle da expressão de seus genes, podendo “ligar” ou “desligar” eles em função da necessidade do organismo ou mesmo de células de determinado tecido deste organismo.

Ao ativar a expressão de um gene, este é primeiramente transcrito em RNA mensageiro (mRNA), que depois transportado do núcleo par ao citoplasma, onde é traduzido em uma proteína. Similarmente, a célula precisa realizar o controle da expressão de seus genes, reduzindo ou desligando sua expressão. Para esta tarefa a célula utiliza o mecanismo de RNAi, que leva ao silenciamento do gene.

O processo de silenciamento de um gene ocorre no citoplasma da célula, e é caracterizado pela degradação especifica de mRNAs, ou seja, o silenciamento do gene ocorre após a sua transcrição (silenciamento gênico pós-transcricional). Em um segundo momento, o efeito do RNAi no citoplasma pode levar a supressão da expressão do gene no núcleo da célula (silenciamento do gene a nível transcricional).

O processo básico do RNAi pode ser dividido em três etapas principais. Primeiro, o mecanismo é ativado pela presença de uma molécula de RNA fita dupla (dsRNA) (denominada de molécula gatilho), que pode ser expressa ou introduzida na célula.

Este RNA é então cortado em pequenos RNAs de fita dupla (21-25nt), chamados de pequenos RNAs interferentes (small interfering RNA, siRNA), por uma ribonuclease III, chamada Dicer.

Na segunda etapa, uma das fitas do siRNA é removida e a fita que permanece (chamada de fita guia) é incorporada a um complexo proteico conhecido como o “complexo de silenciamento induzido por RNA” (RNA Induced Silencing Complex, RISC). Na última etapa, o complexo RISC atua para identificar e degradar mRNAs que tenha a mesma sequência que o siRNA.

Essa característica é que garante a alta especificidade do mecanismo. Em teoria, qualquer mRNA de uma célula pode ser degradado de forma específica via RNAi. Outra característica do mecanismo de RNAi é seu caráter sistêmico, ou seja, após ser ativado em uma célula, um sinal é “transmitido” para as outras células.

Porém, em alguns grupos de espécies, como os insetos, não foi observado uma resposta sistêmica. Este sinal sistêmico é um siRNA, pois além de ser pequeno, assim de fácil movimento, é a molécula que confere a especificidade ao mecanismo.

A tecnologia de RNAi 

O uso aplicado da tecnologia de RNAi está baseado na manipulação do mecanismo para trabalhar a nosso favor. O direcionamento da maquinaria de RNAi é mediado pelas moléculas de dsRNA, assim se desejamos silenciar um gene especifico dentro de uma célula, basta prover a ela um dsRNA que contenha a sequência homologa ao do gene.

Ao silenciar um gene que seja essencial para a célula, ela e posteriormente o organismo como um todo irão morrer. O RNAi poderá estabelecer um novo patamar de controle de pragas, denominado “controle de pragas altamente específico” (Highly Specific Pest Control, HiSPeC), na qual será possível controlar uma espécie determinada sem afetar espécies não alvo.

O fato da especificidade do mecanismo de RNAi ser mediado pela sequência contida no dsRNA, torna a tecnologia versátil, segura e duradoura. Versátil pois é possível desenhar moléculas de dsRNA específicas para uma espécie de praga ou capaz de afetar múltiplas pragas, mesmo sendo um inseto e um fungo por exemplo.

Segura pois garante que, apesar de tanto a espécie praga quanto uma benéfica possuírem o mesmo gene, suas sequências apresentam pequenas alterações, possibilitando criar um dsRNA que afete apenas a praga. Esse aspecto ainda possibilita previsibilidade à ação, pois permite comparar a sequência do dsRNA com as presentes no banco de dados mundial e assim estimar de antemão qual(is) espécie(s) deverá(ão) ser afetada(s) por determinado dsRNA.

Além disso, espera-se uma baixa probabilidade de surgimento de populações resistentes, visto que para escapar do mecanismo, será necessário que o gene alvo seja profundamente alterado. A aplicação da tecnologia de RNAi na agricultura deverá ter como principais focos o controle de pragas, tanto de forma direta (o efeito do RNAi sobre a praga) como indireta (“efeito” do RNAi sobre o hospedeiro), e a modulação da expressão de genes em plantas.

O controle de pragas de forma direta engloba os casos em que a ativação do RNAi por determinado dsRNA irá ocorrer no organismo a ser controlado (um inseto-praga, um fungo ou planta daninha), resultando preferencialmente em morte (quando o gene silenciado é vital), embora fenótipos como baixa virulência (fungos) ou reduzida capacidade de detoxificação ou reprodução (insetos e plantas daninhas resistentes a herbicida) possam ocorrer.

O controle de pragas de forma indireta engloba principalmente o controle de vírus. Neste caso o dsRNA funciona como uma vacina, ativando o RNAi na célula hospedeira para degradar o genoma viral antes de iniciar o processo de infecção.

O primeiro passo para usar o RNAi no controle de uma praga é a obtenção de suas informações genômicas (sequência dos genes), que serão utilizadas para selecionar genes alvo potenciais.

Posteriormente, ensaios em laboratório irão demonstrar a essencialidade deste(s) gene(s) à sobrevivência da praga, e identificar a sequência apropriada do dsRNA a ser utilizado na estratégia de controle via RNAi. As formas de empregar a tecnologia pode ser via geração de plantas que produzam o dsRNA (via transgenia) ou a produção da molécula do dsRNA para aplicação direta, via pulverização por exemplo.

O emprego da transgenia para a geração de plantas resistentes a pragas via RNAi (HIGS, Host Induced Gene Silencing) é atualmente a única estratégia utilizada, visto ser um procedimento já regulamentado na grande maioria dos países. No Havaí, desde de 1998 é cultivado um mamoeiro transgênico com resistência ao vírus da mancha anelar (Papaya ringspot virus, PRSV) mediada por RNAi.

Em 2016 o governo do Canadá autorizou o plantio de um cultivar de milho com resistência a Diabrotica virgifera mediada por RNAi, sendo este o primeiro caso de uso comercial de RNAi para controle de inseto. O uso tópico de dsRNAs tem ganhado grande interesse, pois representa uma alternativa efetiva para fornecer muitos dos benefícios desta tecnologia sem ter que criar OGMs.

Neste caso o dsRNA é produzido in vitro, via síntese química ou em microrganismos como bactérias e leveduras, podendo ser fornecido à planta via sistema radicular ou pulverização. No caso de insetos e patógenos (fungos), estes podem absorver o dsRNA via ingestão junto ao alimento (planta hospedeira, semente tratada), ou via absorção direta do ambiente.

No caso de vírus, a aplicação tópica de dsRNA poderá ser utilizada para proteger as plantas contra a infecção viral, pois o dsRNA irá funcionar com uma “vacina”. Entretanto, ainda não há legislação específica sobre o uso tópico de RNAi na agricultura em nenhum país. No Brasil existe discussões técnicas dentro da CTNBio [Comissão Técnica Nacional de Biossegurança] e do Mapa [Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento] buscando estabelecer os critérios para a regulamentação desta tecnologia.

Apesar da grande versatilidade da tecnologia, há consenso que o sucesso do controle de pragas via RNAi irá variar em função da estratégia de uso da tecnologia (OGM, tópico) e espécie alvo, visto que nem todas as espécies de pragas tem o mesmo nível de sensibilidade a ingestão de dsRNAs.

Além disso, mesmo em espécies mais sensíveis, condições fisiológicas e genéticas podem ter um impacto negativo na eficiência da tecnologia. Por exemplo, é de conhecimento que os vírus são capazes de prejudicar o mecanismo de RNAi, e que existem inúmeros vírus que infectam insetos de forma não letal (infecção crônica).

Neste cenário, um inseto que esteja infectado por um vírus poderá ser menos sensível ao RNAi, assim a infecção viral poderá ser benéfica para o inseto a ponto de haver uma “seleção natural” para insetos infectados no campo.

Fonte: Abrates, Informativo Abrates , edição especial XX Congresso Brasileiro de Sementes

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