Autores:

  • Arthur Arrobas Martins Barroso – Eng. Agrônomo, Dr. Universidade Federal do Paraná
  • Sâmia Rayara de Sousa Ribeiro – Eng. Agrônomo, MSc. Universidade Federal do Paraná
  • Caio Vitagliano Santo Rossi- Eng. Agrônomo, MSc. Corteva Agriscience
  • Luiz Henrique Zobiole – Eng. Agrônomo, Dr. Corteva Agriscience
  • Marcel Sereguin Cabral de Melo – Eng. Agrônomo, Dr. Bayer

Introdução e Objetivos

Esta revisão é a segunda parte de três informes técnicos dedicados a elencar e discutir a identificação da resistência de plantas daninhas à herbicidas. A resistência de plantas daninhas a herbicidas pode estar ligada a mecanismos primários de resistência relacionados ao local de ação do herbicida (RELA) (YUAN et al., 2007; YU; POWLES, 2014) ou a mecanismos não-relacionados ao local de ação do herbicida (N-RELA), discutidos no informe três. Neste trabalho, temos como objetivo revisar brevemente as metodologias para identificação dos mecanismos de resistência relacionados ao local de ação (RELA) do herbicida.

Material e Métodos

Esta revisão teve por base a busca de trabalhos atuais na literatura científica e práticas utilizadas a campo e em laboratório.

Resultados

Um primeiro mecanismo de resistência RELA se dá pela alteração/deleção de bases nitrogenadas em genes. Inicialmente, deve-se conhecer o mecanismo de ação do herbicida, e uma vez conhecido o mecanismo e a enzima onde o herbicida atua, deve-se buscar a sequência gênica responsável pela produção dessa enzima (gene). Para isso, podem ser consultadas bibliografias específicas que contenham estas sequências ou buscá-las em depósitos de genes, como o “GenBank”, site que reúne todas as sequências encontradas no mundo (www.insdc.org).

Uma vez em posse desta sequência, esta é comparada com os genes da planta-teste. Para isso, deve-se sequenciar o gene da planta supostamente resistente.

O primeiro passo para o sequenciamento genético envolve atividades de extração do DNA da planta, amplificação do gene em reações de cadeia da polimerase (ou PCR – polymerase chain reaction), sequenciamento e comparação dos nucleotídeos em programas ou sites específicos (Figuras 1, 2 e 3). Após a identificação destes trechos de DNA, com auxílio de empresas particulares ou laboratórios próprios, o DNA deve passar ainda por processos de purificação. Uma vez obtida esta sequência, a mesma será submetida ao pareamento com a sequência já conhecida do gene, a fim de se verificarem diferenças de nucleotídeos, que poderão ou não formar diferentes aminoácidos aminoácidos. A partir destas diferenças, diferentes proteínas e diferentes enzimas, alterando assim a afinidade do sítio-alvo com o herbicida, é constatado o grau de resistência à planta.

Conhecer cada uma destas mutações é importante para se avaliar o espectro da resistência. Tem-se, por exemplo, que a resistência aos herbicidas inibidores da ACCase, dependendo da mutação do gene, pode ocorrer para o grupo químico dos ariloxifenoxipropionatos (fops), ciclohexanodionas (dims) e fenilpirazolinas (dens), individualmente, ou nos três grupos juntos. As substituições nas posições 1.781, 2.078 e 2.088 do gene ACCase são as mais preocupantes, uma vez que geram elevados fatores de resistência aos três grupos químicos (POWLES; YU, 2010). Por outro lado, algumas mutações geram resistência a apenas um grupo químico, como as mutações Trp-2.027-Cys e Ile-2.041-Asn, que causam resistência apenas aos “fops” (LIU et al., 2007). Nestes distintos casos, poderiam ou não ser aplicados herbicidas do tipo “dim”para o controle da resistência.

Uma vez conhecidas as mutações de nucleotídeos, a resistência pode ser mais facilmente detectada via marcadores “dCAPS”, que são marcadores de genes. Estas mutações somadas ao uso de enzimas de restrição, geram diferentes padrões de bandas observadas em gel de agarose. Maiores detalhes podem ser encontrados na literatura (DÉLYE; BOUCANSAUD, 2008; GIACOMINI et al., 2017; KAUNDUN et al., 2019).

Além de sofrer alterações, os genes das plantas podem ser diferencialmente expressos. Uma superexpressão, pode gerar enzimas em quantidades maiores do que o potencial inibitório do herbicida aplicado. Para se identificar uma possível superexpressão da enzima na planta, segue-se metodologia parecida com a que foi descrita anteriormente. Porém, desta vez, a extração deverá ser do RNA da planta (ácido ribonucleico). Esta diferença deve-se ao fato de que, agora, este material será submetido a uma análise de PCR em tempo real. Isso significa que a replicação do material genético será contada. Para isso, também é realizada a replicação de outro gene da planta para a comparação dos níveis de expressão do gene da enzima. Pode-se utilizar como gene de controle o gene da ubiquitina, actina, dentre outros. No final, tem-se a quantificação relativa da cópia genômica e a transcrição de determinado gene em plantas suscetíveis e resistentes.

Figura 1. Extração de DNA da espécie capim-amargoso (Digitaria insularis), Fort Collins, CO – EUA, 2011. Fonte: Melo, M.S.C.
Figura 2. Amplificação de regiões do DNA da espécie capim-amargoso (Digitaria insularis) relacionadas a enzima EPSPs, Fort Collins, CO – EUA, 2011. Fonte: Melo, M.S.C.
Figura 3. Gel de eletroforese de regiões amplificadas do DNA da espécie capim-amargoso (Digitaria insularis) relacionadas a enzima EPSPs , Fort Collins, CO – EUA, 2011. Fonte: Melo, M.S.C.

A presença deste mecanismo de resistência pode ou não influenciar as doses toleradas para cada herbicida, em cada planta, e o comportamento desta população frente a uma suscetível. Tem-se, por exemplo, que para Amaranthus palmeri, a maior superexpressão da EPSPS, não está ligada a maiores fatores de resistência, diferentemente do observado para Kochia scoparia, onde quanto maior a superexpressão do gene, maior a tolerância ao glyphosate. Neste último caso, a continuidade da aplicação do herbicida só tende a selecionar populações mais e mais resistentes, com maiores números de cópias do gene (GAINES et al., 2016).

Além do gene, a resistência pode decorrer da maior atividade da enzima-alvo. A planta com mais enzimas torna-se resistente às quantidades de herbicida aplicadas (GAINES et al., 2010; POWLES; YU, 2010). Para identificar a atividade de enzimas, são necessários trabalhos que quantifiquem compostos ligados à sua ação. Estas medições podem ser realizadas utilizando-se de diferentes concentrações (doses) e momentos antes e/ou após a aplicação do herbicida para se conhecer a influência do agente externo; neste caso, o herbicida, na atividade enzimática. Cada mecanismo de ação tem sua enzima específica, e as metodologias devem ser consultadas em literatura específica, como na revisão feita por Dayan et al. (2015), “Biochemical markers and enzyme assays for herbicide mode of action
and resistance studies”.

Ainda com relação aos mecanismos RELA, existe uma maneira indireta de se investigar a possibilidade de mutações na enzima onde o herbicida atua. Conhecendo sua rota, por exemplo, para o glyphosate, sabemos que a inibição da EPSPS gera o acúmulo do ácido chiquímico. A determinação deste composto e a ausência de seu acúmulo após a aplicação do herbicida indicam que a enzima não está sendo inibida, ou que está super expressada.

Nestes casos, podem ser coletados discos foliares de tecidos ativos e sem estresse da espécie em estudo, na área em que se objetiva avaliar a resistência. Neste método, é necessário que haja uma população suscetível para comparação. Estes discos são depositados em placas de titulação contendo o herbicida em solução. Estas doses variam de acordo com o herbicida e podem ser consultadas em literaturas específicas, como para o herbicida glyphosate (SHANER et al., 2005), inibidores da PROTOX (FALK et al., 2006), inibidores da ALS (UCHINO et al., 1999). Estas placas são incubadas em condições controladas e com a adição de compostos específicos (ex: HCL para glyphosate), e em seguida o composto é determinado via espectrofotometria para leitura em comprimento de onda específico. A quantidade do composto é determinada pela comparação dos valores obtidos em relação a uma curva-padrão estabelecida com quantidades conhecidas do composto a ser determinado.

Conclusão 

Identificar se uma planta é resistente a determinado herbicida é mais simples do que se determinar o porquê. Aproximar o produtor rural da necessidade destes conhecimentos é fundamental para o manejo da resistência. Novas técnicas, mais ágeis e simples, devem ser tratadas como prioridade nos próximos anos na investigação dos mecanismos de resistência de plantas daninhas a herbicidas, de forma a colaborar positivamente no manejo de controle e de prevenção aos avanços deste problema.

Referências Bibliográficas

DAYAN, F. et al. Biochemical markers and enzyme assays for herbicide mode of action and resistance studies. Weed Science, v. 63, sp1, p. 23-63, 2015.

DÉLYE, C.; BOUCANSAUD, K. A molecular assay for the proactive detection of targer site-based resistance to herbicides inhibiting acetolactate sythase in Alopecurus myosuroides. Weed Research, v. 48, p. 97-101, 2008.

FALK, J.S. et al. Rapid assay evaluation of plant response to protoporphyrinogen oxidase (Protox) – inhibiting herbicides. Weed Technology, v. 20, p. 104–112, 2006.

GAINES, T.A. et al. Gene amplification confers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, v. 107, p. 1.029-1.034, 2010.

GAINES, T.A. et al. EPSPS gene copy number and whole-plant glyphosate resistance level in Kochia scoparia. Plos One, v. 11, 2016.

GIACOMINI, D.A. et al. Optimizing RNA-seq studies to investigate herbicide resistance. Pest Management Science, v. 74, p. 2.260-2.264, 2017.

KAUNDUN, S.S. et al. Derived polymorphic amplified cleaved sequence (dPACS): a novel PCR-RFLP procedure for detecting known single nucleotide and deletion-insertion polymorphisms. International Journal of Molecular Science, v. 20, 2019.

LIU, W.J. et al. Single-site mutations in the carboxyltransferase domain of plastid acetyl-CoA carboxylase confer resistance to grass-specific herbicides. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, v. 104, p. 3.627–3.632, 2007.

POWLES, S.B.; YU, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Review of Plant Biology, v. 61, p. 317-347, 2010.

SHANER, D.L. et al. A rapid in vivo shikimate accumulation assay with excised leaf discs. Weed Science, v. 53, p. 769-774, 2005.

UCHINO, A. et al. Light requirement in rapid diagnosis of sulfonylurea-resistant weeds of Lindernia spp. (Scrophulariaceae). Weed Technology, v. 13, p. 680–684, 1999.

YU, Q.; POWLES, S.B. Resistance to AH-AS inhibitor herbicides: current understanding. Pest Management Science, v. 70, p. 1.340–1.350, 2014.

YUAN, J.S. et al. Non-target-site herbicide resistance: a family business. Trends in Plant Science, v. 12, p. 6-13, 2007.

Fonte: Comitê de Ação a Resistência aos Herbicidas – HRAC-BR

Foto de capa: Fonte – Melo, M.S.C.

Texto originalmente publicado em:
Comitê de Ação a Resistência aos Herbicidas - HRAC-BR
Autor: HRAC-BR

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